En kromatografisk revolusjon

Kromatografi 1966 - 2016

Bioingeniøren fyller 50 år i år, og i den forbindelse har vi funnet fram noen av bladets første fagartikler. Vi publiserer artiklene på nytt, og har bedt fagpersoner med bred erfaring innen sitt felt om å lese de gamle artiklene og trekke linjer fra 1966 og fram til i dag.

Fagansvarlig bioingeniør Ruth-Anne Larsen har tatt utgangspunkt i artikkelen «Kromatografi», skrevet av Egil Jellum. Den stod i Fysiokjemikeren (som Bioingeniøren da het) nr. 3, 1966.

Kromatografiinstrumenter med ulike bruksområder og analyseprinsipper blir stadig forbedret, og brukes i stor skala både i medisinske laboratorier og i industrien. Ved Avdeling for Klinisk Farmakologi ved St. Olavs Hospital i Trondheim, er kromatografi - sammen med massespektrometri - den absolutt viktigste analysemetodikken.

Kromatografi i 1966

For 50 år siden ble det publisert en artikkel i Fysiokjemikeren om kromatografi, skrevet av Egil Jellum (Institutt for Klinisk Biokjemi, Rikshospitalet). Artikkelen var formulert som en lærebok med et nokså vanskelig språk og med mye teori. Forfatteren beskriver analyseprinsipper ved kromatografiske separasjonsmetoder, men hvordan metodene ble brukt i praksis, står det ingenting om. Det hadde vært morsomt å vite hvilke analytter som var aktuelle å finne for 50 år siden, hvordan kromatografi fungerte i praksis. Forfatteren skriver litt om hvilken separasjonsevne en gasskromatografisk kapillærkolonne har, og hvordan dette kan måles ved hjelp av HETP (Height of an Equivalent Theoretical Plate).

Det står derimot ingenting om hvilke deteksjonsmetoder som ble benyttet. Massespektrometri som deteksjonsmetode ble så vidt tatt i bruk på 1960-tallet, da tilknyttet gasskromatografer, men i teksten er ikke noe slikt beskrevet. Forfatteren skriver at det hovedsakelig er tre typer kromatografi som er viktig: Fordelings-, adsorpsjons- og ionebytterkromatografi, og gjerne en overlapping mellom disse. Og her er det samsvar med det vi gjør i dag. Dagens kromatografimetoder bygger på en blanding av disse metodene.

Erfaringer fra egen avdeling

På begynnelsen av 1980-tallet tok Avdeling for Klinisk Farmakologi ved St. Olavs Hospital i bruk de første kromatografinstrumentene. Vi hadde gasskromatografer (GC) med flammeionisasjonsdetektor (FID) og høytrykk væskekromatografer (HPLC) med UV-detektor. Ulike alkoholer ble analysert med GC, mens HPLC ble brukt for legemiddelanalyser. Bruken av disse instrumentene var ikke optimal; analysetiden var lang og kromatografitoppene små. Prøvene ble injisert med sprøyte og toppene kom ut på en papirrull fra detektoren.

De første massespektrometrene (MS) kom til avdelingen i 1997, og ble koblet til både GC og LC. Og det var oppstarten av LC-MS som gjorde at avdelingen vokste. Flere ulike legemidler i serum kunne analyseres, og screening av rusmidler i urin ble utviklet. LC-MS utgjorde en stor del av instrumentparken fra slutten av 90-tallet frem til begynnelsen av 2000-tallet. På disse instrumentene er det blitt analysert mange ulike legemidler og rusmidler i både serum, blod og urin. Fortsatt analyserer vi ulike alkoholer ved hjelp av GC-FID, mens noen rusmidler og andre toksiske alkoholer som etylenglykol (frostvæske) blir analysert på GC-MS.

Legemiddelassistert behandling (LAR)

I 1998 begynte vi å få inn urinprøver tatt i forbindelse med legemiddelassistert rehabilitering (LAR). LAR er et program der opioidavhengige får behandling med opioidholdige legemidler (substitusjonsbehandling) (1). Avdelingen var den første i landet som utførte screening av rusmidler i urin ved hjelp av LC-MS. Antall prøver har siden økt betraktelig, fra rundt 15 000 i året til over 100 000. Også analyser av legemidler har økt jevnt og trutt. I dag analyserer vi rundt 140 forskjellige legemidler, cirka 70 forskjellige rusmidler, analyser av ukjente stoffer i tabletter, pulver, miksturer, i tillegg til en del spesialanalyser.

Tandem-massespektrometri

Ved bruk av LC-MS er forarbeidet av prøvene tidkrevende, og en modernisering var påkrevd. Fortsatt analyseres det ganske mange legemidler på LC-MS, men vi har stort sett gått over til å bruke LC-MSMS.
Forskjellen mellom en MS og MSMS (tandem-massespektrometri) er at førstnevnte har én kvadrupol, mens MSMS har to. I en MS blir prøven ionisert i en ionekilde for så å bli filtrert gjennom et massefilter (kvadrupol 1) og så detektert. I en MSMS går den ioniserte prøven fra kvadrupol 1 videre inn i en kollisjonscelle og blir deretter filtrert på nytt i et massefilter (kvadrupol 2) og så ført inn i detektoren (2). En MSMS skal ha bedre sensitivitet og spesifisitet enn en MS.

Daglig brukes LC-MSMS til screening av rusmidler i urin, gjerne opp til 250 prøver fra ulike pasienter per dag. Noen av fordelene ved å gå fra LC-MS til LC-MSMS er at klargjøring av prøver før de analyseres er blitt enklere, det kan analyseres flere ulike analytter i en og samme prøve og prøvevolumet er blitt mindre. I tillegg til rusmiddelscreening i urin har stadig flere av TDM-analysene (Therapeutic Drug Monitoring) i serum gått over til å analyseres på LC-MSMS, som for eksempel Lamotrigin, Risperidon, Venlafaksin, Klozapin og mange flere. I disse dager har vi også begynt med å analysere rusmidler i serum på LC-MSMS, og stadig utvikler FoU-seksjonen nye metoder. Også screening av rusmidler i hår gjøres med LC-MSMS.

Screening med LC-QTOF

Kromatografi er ett av prinsippene i Liquid Chromatography-Quadrupol Time of Flight massespektrometer (LC-QTOF). Dette instrumentet kan brukes til nøyaktig massebestemmelse av rusmidler, legemidler og gifter i ekstrahert biologisk materiale (blod, serum, urin). På vårt laboratorium brukes det til screening av prøver med ukjent innhold. Ved hjelp av kromatografi separeres først stoffer i prøven med den analytiske kolonnen. I ionekilden dannes det ioner av stoffene, og de nøyaktige massene til ionene bestemmes ved å måle flyvetiden (TOF) over en bestemt avstand. Den er proporsjonal med vekta på ionene; dess tyngre ionene er, dess lengre tid bruker de, og flygetida blir konvertert over til nøyaktig ionemasse. Ionene kan også bli slått i stykker fra det opprinnelige ion (moderion) til datterion. Datterionene vil da danne et unikt fingeravtrykk av stoffene og danne massespektre. Både moderion- og datterion-massespektre kan så sammenliknes med database/bibliotek.

Andre instrumenter

ICP-MS og UPC2-MSMS er to andre kromatografiinstrumenter. ICP-MS står for Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, og brukes for å bestemme innholdet av grunnstoffer i prøver. Prinsippet er at ICP-kilden omdanner atomene i grunnstoffet til ioner. Ionene blir separert, og så detektert av et massespektrometer (3). Det kan analyseres mange forskjellige grunnstoffer som for eksempel aluminium, kobber og bly, og selv om prøvematerialet som oftest er forskjellige blodkomponenter og urin, er det også mulig å analysere andre spennende materialer.

UPC2-MSMS (Ultra Performance Convergence Chromatography) er en av våre nyeste anskaffelser, og kan brukes til å kvantifisere strukturelle analoger (kjemiske forbindelser som ligner på hverandre): Isomere, enantiomere og diastereomere strukturer (4). Den er blant annet nyttig for å skille gateamfetamin fra medisinsk foreskrevet amfetamin.

Framtiden

Store forandringer har skjedd innen kromatografi de siste 50 årene, og ved vår avdeling driver vi kontinuerlig forskning, utvikling og implementering av ny metodikk. Det er ønskelig at stadig flere og nye legemidler blir monitorert. Vi får stadig flere prøver der markører påviser alkoholmisbruk, og det er betydelige utfordringer med å avsløre ulike nye rusmidler som er i omløp.

For 50 år siden hadde neppe forfatteren som skrev om kromatografi i Fysiokjemikeren noen anelse om hvilket omfang denne metodikken skulle få.