Nye metoder for påvisning og karakterisering av Klebsiella pneumoniae

Av Kenneth Lindstedt, PhD-stipendiat, Institutt for medisinsk biologi, UiT – Norges arktiske universitet

Studien ble utført av PhD-stipendiat Kenneth Lindstedt og postdoktor Dorota Buczek, i samarbeid med flere, og ledet av professor Arnfinn Sundsfjord ved UiT – Norges arktiske universitet. Den er publisert i Gut Microbes (1).

I vår studie ble to molekylære metoder, kvantitativ PCR (qPCR) og helgenom-metagenomikk (WMS), sammenlignet med tradisjonell selektiv kultur for påvisning av Klebsiella pneumoniae i avføringsprøver fra mennesker. Studien viser at begge metodene er pålitelige for å påvise bakterien og har et stort potensial til bruk i infeksjonskontroll.

Klebsiella pneumoniae – en økende trussel

Klebsiella pneumoniae er en viktig årsak til alvorlige sykehusrelaterte infeksjoner og smitteutbrudd. Denne bakterien er rangert som den fjerde vanligste i Norge blant de bakterieartene som forårsaker infeksjoner i blodbanen (sepsis). Den er også en potent driver i utviklingen av antibiotikaresistens. Å være bærer av K. pneumoniae er en risikofaktor for infeksjoner og spredning av antibiotikaresistens (2).

De kulturbaserte metodene som i dag er i bruk for å undersøke om man er bærer av K. pneumoniae i tarmen er tid- og ressurskrevende, og de har mangelfull sensitivitet og spesifisitet. De har også problemer med å oppdage et eventuelt mangfold av K. pneumoniae i prøvene. Vi trenger bedre diagnostiske verktøy for å kunne påvise K. pneumoniae i tarmen raskere og mer presist – for å spore spredningen av bestemte kloner av bakterien ved smitteutbrudd.

qPCR og metagenomikk – reproduserbare og pålitelige metoder

Både qPCR og helgenom-metagenomikk ble vurdert for påvisning av K. pneumoniae i 103 avføringsprøver samlet fra voksne personer rekruttert gjennom Tromsøundersøkelsen. Prøvene hadde gjennomgått kulturbasert påvisning ved bruk av Klebsiella-spesifikk SCAI-medium (Simmon’s citrat agar med inositol), som del av en tidligere studie av K. pneumoniae-bærerskap (3).

Vi gjorde DNA-ekstraksjon på alle avføringsprøvene ved bruk av PureLink Microbiome DNA Purification-sett. For å maksimere følsomheten ble prøvene dyrket på nytt på SCAI-medium, og vi gjorde en ‘sveip’ av veksten på plate, som så gjennomgikk DNA-ekstraksjon.

Vi valgte ZKIR-qPCR-analyse for denne studien. Denne nylig utviklede qPCR-analysen retter seg mot en konservert 78 bp genomisk region, ZKIR (zur-khe intergenic region), som er svært spesifikk for nært beslektede arter innen Klebsiella pneumoniae species-komplekset (4).

Helgenom-metagenomikk ble utført med Illumina Novaseq 6000, med over 20 millioner parvise endesekvenser (paired-end reads).

Høyest følsomhet med ZKIR-qPCR

ZKIR-qPCR direkte fra avføringsprøven hadde høyest sensitivitet og oppdaget K. pneumoniae i 100 prosent av de dyrkingspositive prøvene, og i 22 prosent av de dyrkingsnegative prøvene. qPCR-følsomheten ble forbedret til påvisning av K. pneumoniae i 49 prosent av dyrkingsnegative prøver ved analyse av DNA fra anrikning på SCAI-medium. ZKIR-qPCR ga også en reproduserbar og nøyaktig kvantifisering av K. pneumoniae i prøvematerialet.

Selv om WMS er en tidkrevende metode og mindre følsom enn ZIKR-qPCR, så ga metoden en nøyaktig påvisning av K. pneumoniae på stammenivå (ST-type) og diversitet - forutsatt en relativ andel av minst 0,1 prosent K. pneumoniae i prøvematerialet.

Potensielle bruksområder

Fordelen med ZKIR-qPCR er at den er både rimelig og rask (omtrent fire timer fra prøven er tilgjengelig til ferdig resultat). Den kan også automatiseres og gi en høy prøvegjennomstrømning, og har dermed et stort potensial som et hurtig diagnostisk verktøy for å skille mellom K. pneumoniae positive og negative prøver.

Nøyaktigheten med helgenom-metagenomikk i påvisning av K. pneumoniae på stammenivå understreker en mulig fremtidig rolle i infeksjonskontroll og smittespredning på helseinstitusjoner.

Studien er en del av KLEB-GAP-prosjektet¹ og ble utført med stor hjelp fra Nasjonal kompetansetjeneste for påvisning av antibiotikaresistens (K-res) ved Universitetssykehuset Nord-Norge. Studien er finansiert av Trond Mohn-stiftelsen gjennom deres nasjonale forskningsprogram på antibiotikaresistens (https://mohnfoundation.no/tematisk/nasjonalt-forskningsprogram-pa-antibiotikaresistens-amr/) og Helse Nord RHF. Studien er godkjent av Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk, Nord-Norge.

Referanser

1. Lindstedt K, Buczek D, Pedersen T, Hjerde E, Raffelsberger N, Suzuki Y, et al. Detection of Klebsiella pneumoniae human gut carriage: a comparison of culture, qPCR, and whole metagenomic sequencing methods. Gut Microbes. 2022;14(1):2118500
2. Gorrie CL, Mirceta M, Wick RR, Edwards DJ, Thomson NR, Strugnell RA, et al. Gastrointestinal Carriage Is a Major Reservoir of Klebsiella pneumoniae Infection in Intensive Care Patients. Clin Infect Dis. 2017;65(2):208-15.
3. Raffelsberger N, Hetland MAK, Svendsen K, Smabrekke L, Lohr IH, Andreassen LLE, et al. Gastrointestinal carriage of Klebsiella pneumoniae in a general adult population: a cross-sectional study of risk factors and bacterial genomic diversity. Gut Microbes. 2021;13(1):1939599.
4. Barbier E, Rodrigues C, Depret G, Passet V, Gal L, Piveteau P, et al. The ZKIR Assay, a novel Real-Time PCR Method for the Detection of Klebsiella pneumoniae and Closely Related Species in Environmental Samples. Appl Environ Microbiol. 2020.

¹ Et pågående prosjekt i Norge som involverer UiT, UNN, Stavanger universitetssjukehus, Veterinærinstituttet, Havforskningsinstituttet, samt flere internasjonale partnere, med sikte på å forstå Klebsiella pneumoniae fra et «One Health-perspektiv».