Proteomikk - snart klart for klinikken?

Et proteom kan defineres som hele proteininnholdet i celler, vev eller organismer. Det humane genomet inneholder litt over 20 000 gener som transkriberes til RNA og videre translateres til protein. I denne prosessen økes kompleksiteten, blant annet med alternativ spleising og ulikt uttrykk av mRNA. I tillegg kan proteiner modifiseres med post-translasjonelle modifikasjoner som øker kompleksiteten betraktelig. Man anslår at det finnes om lag en million forskjellige proteiner i humane proteom. Dette gjør proteinanalyser til en utfordrende oppgave. Det virket lenge nærmest utenkelig å skulle få til totalproteomanalyser.

Stadig forbedrede metoder innen proteomikk, spesielt massespektrometriske metoder, er riktig nok blitt utviklet de to siste tiårene. Disse nye metodene har imidlertid hovedsakelig vært benyttet innen forskning og lite i klinikk og diagnose. Denne metodeutviklingen og forskningen har likevel bidratt mye i jakten på nye biomarkører som skal kunne brukes i diagnostisering.

Proteomikkmetoder

Identifikasjon av proteiner ble for alvor forenklet og effektivisert etter innføringen av nye ioniseringsteknikker for store biomolekyler. Dette muliggjorde nøyaktig massespektrometerbestemmelse av blant annet peptider og proteiner. Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) og ElectroSpray Ionisation (ESI) ble etablert av henholdsvis Tanaka og Fenn på tidlig 90-tall, og begge ble tildelt Nobelprisen i kjemi for dette arbeidet i 2002 (1, 2). Disse teknikkene er såkalte «myke» ioniseringsteknikker som danner gassfaseion uten at peptidkjeden forstyrres.

Selv om uttrykket proteomikk ble etablert etter at massespektrometriske metoder ble hovedanalyseverktøy, omfatter verktøykisten innen proteomikken flere metoder enn de MS-baserte. I prinsippet kan vi definere proteomikk som alle metoder brukt til anrikning, rensing, separasjon, deteksjon og karakterisering av proteiner. Det være seg presipitering, kolonnebaserte separasjonsteknikker, gelelektroforese, antistoffbasert rensing/deteksjon, strukturanalyse og selvfølgelig massespektrometriske metoder for bestemmelse og kvantitering.

Arbeidsflyten (Figur 1) i proteomikk er avhengig av riktige prosedyrer/protokoller hele veien fra proteinekstraksjon fra celler/vev til deteksjon av peptider. Sensitive deteksjonsmetoder gjør metoden avhengig av å ikke ha kontaminerende faktorer i prøven.

FIGUR 1

Figur 1: Typisk arbeidsflyt for proteomikkanalyser.

Separasjon av proteiner
Etter at vevet/cellene er lysert, må proteinene separeres. Tradisjonell proteomikk har her brukt 2D gelelektroforese der proteinene først separeres med hensyn på isoelektrisk punkt. Videre separeres proteinene etter størrelse i en polyakrylamid matrix i et elektrisk felt, hvor de små proteinene vandrer lenger enn de store.

Denne metoden er videre utviklet for å kunne benyttes i kvantitativ proteomikk, der opp- eller nedregulering av ulike proteiner kan undersøkes. Metoden kalles 2D-DIGE (differential expressed gel electrophoresis) (3). Prinsippet går ut på å farge to ulike prøver med to ulike fluoroforer (for eksempel propyl-cyanin3 (Cy3) og methyl-Cy5) før 2D gelelektroforesen utføres. Fargingen vil påvirke vandringshastigheten likt, og like proteiner i de to prøvene vil derfor vandre likt i gelen. Proteinene i de to prøvene i en og samme gel kan så visualiseres og kvantifiseres individuelt ved hjelp av en laserscanner ved to ulike bølgelengder. Det vil si, det kan være mer/mindre av et protein i en prøve enn i en annen (for eksempel sykt vs. friskt eller behandlet vs. ubehandlet) (Figur 2). Proteinspotene på gelen kan identifiseres med massespektrometri. Proteinene som identifiseres som opp- eller nedregulerte kan være biomarkører for den sykdommen/tilstanden som er studert sammen med kontrollprøven.

FIGUR 2

Figur 2: DIGE 2D gelektroforese. Proteiner fra ulike prøver merkes med ulike fluoroforer og blandes sammen. Proteinene separeres både når det gjelder isoelektriske punkt og størrelse. Signalstyrken til de ulike proteinspotene sammenlignes og relativ kvantitering gjøres.

I tillegg til gelelektroforese blir også kromatografiske metoder brukt for separasjon/anriking av proteiner. Dette er standard FPLC/HPLC-metoder som for eksempel ionebytter-, gelfiltrering-, affinitetskromatografi.

Massespektrometri

Proteiner/peptider identifiseres etter separasjon med ulike massespektrometriske teknikker (4) (figur 3). I de tilfeller hvor proteinene er separert ned til enkle proteiner, som etter 2D-gelektroforese, er det vanligst å benytte MALDI-TOF MS for identifikasjon. Proteiner behandles med protease (normalt trypsin) og peptidene massebestemmes. Peptidmassene gir det som kalles et peptidmassefingerprint (PMF). Proteinet bestemmes ved at proteiner i en database teoretisk proteasekuttes og gir teoretiske fingerprint. Disse teoretiske mønstrene sammenlignes så med det eksperimentelle fingerprint. Proteinet i databasen som har et fingerprint mest likt det eksperimentelle gir høyest «score», og blir angitt som det mest sannsynlige proteinet.

FIGUR 3

Figur 3: Proteinidentifisering ved hjelp av massespektrometriske metoder. Enten ved hjelp av MALDI (enkle proteinblandinger) eller LC-MSMS (komplekse proteinblandinger).

For identifikasjon av proteiner i en mer kompleks blanding, benyttes HPLC in-line med massespektrometeret. Peptider etter trypsinkutting separeres på en revers-fase kolonne og elueres direkte inn i massespektrometeret utstyrt med en elektrospraykilde. Fordelen med dette er at bare ett (eller svært få) peptider ankommer instrumentet samtidig, slik at spektrene blir mye enklere å tyde.

Så snart peptidene er overført fra fast form (MALDI) eller væske (ESI) til gassfaseioner inn i vakuumet i massespektrometeret, må m/z verdien (forholdet mellom masse og ladning) og intensiteten måles. I tillegg er det ofte nødvendig å fragmentere (MSMS) hvert peptid før massespekteret tas opp. Denne fragmenteringen fører hovedsakelig til spaltning av amid-bindingen i peptidkjeden og genererer overlappende serie av N- og C-terminale fragmenter (kalt b- og y-ioner). Dette gir sekvensinformasjon fra hvert enkelt peptid som blir ionisert og er med på å forbedre identifikasjonssikkerheten drastisk.

Kvantitativ proteomikk
I tillegg til identifikasjon av proteiner kan også mengden av ulike proteiner bestemmes, enten relativt i forhold til hverandre eller absolutt. Ulike teknikker kan benyttes, og målrettet kvantifisering gjøres fortsatt oftest med vanlig antistoffbasert westernanalyse. I de tilfellene der gode antistoffer ikke er tilgjengelige, hvis det er mye uspesifikk binding av antistoffer eller hvis flere proteiner ønskes kvantitert samtidig, kan massespektrometerbaserte metoder med fordel benyttes (5).

For fullproteomkvantifisering er relativ mengde av proteiner i for eksempel behandlet vs. ubehandlet prøve (eller sykt vs. friskt vev) mulig. Her benyttes merking av proteinene med isotop (for eksempel SILAC, iTraq) slik at de parvis like peptidene (etter trypsinkløyving) får ulik masse i massespektrometeret, og intensiteten blir et mål på hvor mye det er av de ulike proteinene i de ulike prøvene (Figur 4).

FIGUR 4

Figur 4: Kvantitativ proteomikk. Relativ kvantitering ved å sammenligne signalet til to ulike prøver med forskjellig isotopmerking på enten arginin eller lysin. Direkte kvantitering gjøres ved å sammenligne signalet fra prøven med signalet fra kjent mengde tilsatt peptid.

For målrettet proteomikk kan MS-instrumentene søke etter spesielle peptider fra ønskede proteiner (Figur 4). Til prøven tilsettes da syntetiske, isotopmerkede peptider i kjent mengde, og man søker direkte etter de ønskede peptidene. Enten kan MS-instrumentet scanne i SIM (single ion monitoring) der spesifikke ioner detekteres med stor nøyaktighet og oppløsning, eller MRM (multiple ion monitoring). I MRM brukes massespektrometeret til å måle et ionepar fra hver enkelt analytt, både full-molekylionet og fragmentionet etter fragmentering. Dette øker spesifisiteten og sensitiviteten til analysen.

Proteomikk i klinikken
Påvisning av små proteinforandringer i for eksempel friskt vs. sykt vev/celler, er det vi kan kalle «klinisk proteomikk», og denne metoden kan forbedre tidlig diagnose av kreft og kroniske sykdommer. Hypotesen er da at deteksjon av endring i proteinmønsteret i tidlig fase av en sykdom, kan være med på å etablere biomarkører som gir mulighet for å stille en tidlig diagnose. Som tidligere nevnt er det flere ulike teknikker som kan benyttes, for eksempel DIGE og SILAC. Dette er metoder som gir svar på hvilke proteiner som er opp-/nedregulert i den tilstanden som studeres i forhold til en kontrollprøve, det være seg fra celler eller vev. Etter identifikasjonen av en biomarkør, kan direkte kvantiteringsmetoder brukes målrettet mot disse og en kan kjøre serier med prøver for å stille en diagnose (Figur 5).

FIGUR 5

Figur 5: Proteomikk i klinikken. Biomarkør identifiseres ved relativ kvantitativ proteomikk og pasienter kan screenes ved direkte kvantitativ proteomikk.

Selv om det har blitt gjort utallige forsøk på å identifisere sikre biomarkører for flere tilstander og sykdommer, har man kun i få tilfeller lykkes med å identifisere gode biomarkører for klinisk bruk. Flere biomarkører er blitt identifisert, men valideringsprosessen av disse har ikke ført frem til klinisk bruk. I tillegg er de identifiserte kandidatene ofte proteiner som er oppregulert for flere ulike tilstander, og de har derfor ikke vært tilstrekkelig spesifikke. Med forbedrede høykapasitetsanalyser, samt bedre og raskere validering, vil sannsynligvis nye proteinbiomarkører identifiseres og godkjennes for klinisk bruk i nær fremtid.