Seleksjon og dyrkning av humane mesenchymale celler

• Artikkelen baserer seg på en posterpresentasjon som ble holdt på International Society of Cellular Therapy Congress i Berlin 2006.

Seleksjon og dyrking av humane mesenchymale celler.pdf(108 KB)

Oppmerksomheten rundt stamceller og mulig anvendelse av disse i klinikken har vært stor de senere år, og kartlegging og karakterisering av ulike stamceller og identifisering av deres opphav er et stort forskningsområde. De hematopoietiske stamcellene fra benmargen er best karakterisert, og benmargen er det organet vi vet mest om som kilde for stamceller. Vi vet nå at celler med stamcelleegenskaper finnes i de fleste vev i kroppen.

Mikromiljøet i benmargen regulerer proliferasjonen, modningen og differensieringen av de hematopoietiske stamcellene. Dette mikromiljøet består av stromale celler, som man antar stammer fra en pluripotent celle i benmargen. Man trodde lenge at benmargsstoma kun var et strukturelt rammeverk for de hematopoietiske stamcellene i benmargen. Nå vet vi at stroma består av en heterogen gruppe celler av endoteliale celler, fibroblaster, adipocytter og osteogene celler som har både negativ og positiv reguleringseffekt på proliferasjon og differensiering av de hematopoietiske cellene (1,2). Tidlig på 70-tallet ble det vist at non-hematopoietiske celler i benmargstroma har evne både til selvfornyelse og differensiering til benvev, fett, brusk, muskler og sener (figur 1) (3).

Cellene ble beskrevet som colony-forming-unit-fibroblasts (CFU-F). Cellene hører embryologisk til mesoderm, som de hematopoietiske stamcellene, og de kalles i dag mesenchymale stamceller (MSC), (mesenchyme: del av den embryonale mesoderm, bestående av løst pakkede, udifferensierte celler). Cellenes egenskaper gjør at MSC kan være godt egnet til å reparere ulike typer vev.

Det er også vist at MSC har immunmodulerende effekt, og derfor kanskje kan brukes til å dempe avstøtingsreaksjoner ved allotransplantasjoner (4, 5). Dessuten er det kjent at MSC kan ha en støttefunksjon for de hematopoietiske cellene etter høydosebehandling med autolog stamcellestøtte (6).

Fettvev har også sitt opphav i mesoderm og inneholder en heterogen stromal cellepopulasjon. Studier har vist at det finnes multipotente stamceller i fettvev som har sammenfallende egenskaper med de mesenchymale stamcellene i benmargen (7). Disse cellene har fått betegnelsen ADAS-celler (adipose-derived adult stem cells).

I klinisk sammenheng er fettvev som stamcellekilde interessant fordi fett er lett tilgjengelig, inngrepet krever ingen anestesi og fettvevet er cellerikt.

Vi ønsket å sammenligne vekst og egenskaper til mesenchymale stamceller fra benmarg og fettvev når disse ble dyrket i ulike typer medium.

Materiale og metode

Isolering av ADAS-celler
I samarbeid med kirurgisk avdeling mottok vi fettvev som ble fjernet i forbindelse med plastisk rekonstruksjon. Pasientene ble informert før inngrepet og hadde gitt sitt samtykke til at cellene kunne brukes til forskning. Prosedyren for å isolere ADAS-celler baserte seg på en metode beskrevet av Hauner et al. (8) og videreutviklet i forbindelse med en masteroppgave utført ved Avdeling for celleterapi, RRHF (9). Cellematerialet fra fettsuging ble brakt til laboratoriet umiddelbart etter inngrepet og deretter vasket flere ganger med steril, romtemperert PBS-buffer.

Materialet ble deretter overført til 50 ml buffer pH 7,4, bestående av Krebs-Ringer (Sigma-Aldrich) bufret med 24 mM Hepes (Sigma-Aldrich), collagenase 1,5 mg/ml (Sigma-Aldrich) og bovint serumalbumin 20 mg/ml (StemCellTechnologies Ltd.). Etter 60 minutter ble det delvis oppløste cellematerialet filtrert gjennom et sterilt nylonnett med porestørrelse 250 µm til et nytt rør og sentrifugert. Modne fettceller fløt opp og supernatanten ble kastet. Cellepellet (stromal vascular fraction) ble resuspendert i erytrocytt-lyseringsbuffer for å fjerne erytrocytter.

Etter ytterligere vask ble cellene overført til dyrkningsflasker for videre kultur med DMEM-medium (Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium/Nutrient Mixture F12 Ham 1:1, Sigma-Aldrich) tilsatt 10 % FCS (Biowest, Loire Valley, France) - eller LP02 medium (MacoPharma, Tourcoing, Frankrike) tilsatt 2,5 % platerikt AB-plasma (PRP). Platekonsentrat fra blodgivere ble fordelt i passende volumer før nedfrysing og tint for hvert oppsett. Begge typer medium ble tilsatt Glutamax og penicillin 100 U/ml + streptomycin 0,1 mg/ml (Invitrogen). Glutamax er en mer stabil form av glutamin som er nødvendig for cellenes energiproduksjon og for protein- og nucleinsyresyntesen. Antibiotika tilsettes for å hindre infeksjon i kulturene.

Isolering av mesenchymale celler fra benmarg
Benmarg ble høstet fra friske, frivillige givere. Mononucleære celler ble deretter isolert ved hjelp av LymphoprepTM (AXIS-SHIELD) for å blant annet fjerne røde celler. Cellene ble vasket og resuspendert i de aktuelle medier: MEMα medium (Invitrogen Life Tecnologies) tilsatt 10 % føtalt kalveserum (Biowest, Saveen Werner) eller LP02 medium med platerikt plasma, og cellene ble deretter overført til dyrkningsflasker for videre kultur.

Mesenchymale celler adhererer til plast. Dette ble utnyttet for å anrike de cellene vi ønsket å gå videre med. Etter to døgn ble non-adherente celler fjernet og adherente celler ble dyrket videre i flasker. 50 % medium ble skiftet hver tredje dag og cellene ble splittet ved cirka 80 % konfluens i flaskene. Ved hver passasje ble celler frosset for senere eksperimenter. Vi benyttet hovedsakelig celler fra fjerde passasje til senere karakterisering. Tabell 1 viser de ulike cellenes (BM-MSC og ADAS) ekspansjon i ulike medier.

Dyrking og differensiering

Cellenes evne til å danne kolonier (CFU-F) er en kontroll på at cellene bevarer sine stamcelleegenskaper. ADAS-celler og MSC fra benmarg som hadde gått til konfluent monolayer i fjerde passasje i de mediene vi ønsket å sammenligne, ble sådd ut i ulike konsentrasjoner i MesenCult Basal Medium (StemCell Technologies) tilsatt et vekstsupplement (StemCell Technologies). Vi lot kulturene gå i 14 dager før mediet ble fjernet og koloniene farget med krystallviolett (se tabell 2).

Differensiering: For å se på differensiering til adipocytter (fett) og osteoblaster (ben) lot vi cellene gå i dyrkningsmediene vi ønsket å sammenligne til flaskene var konfluente. Dyrkningsmediet ble fjernet og erstattet med differensieringsmedium. Vi benyttet ferdige kit fra StemCell Tecnologies (Mesencult Basal Medium tilsatt henholdsvis Adipogenic Stimulatory Supplements eller Osteogenic Stimulatory kit med dexamethasone, β-glyserolfosfat og ascorbinsyre). Differensieringsmediet ble skiftet to ganger i uken. De samme cellene ble dyrket parallelt uten differensieringsmedium og farget for negativ kontroll.
Etter 21 dager ble det laget cytospinn som senere ble farget på Avdeling for Patologi.

Fenotyping: Per i dag finnes ikke veldefinerte antigenmarkører på mesenchymale stamceller, og det er derfor vanskelig å isolere disse cellene fra andre stromale celler. Det er en heterogen cellepopulasjon man undersøker, og fenotypen kan påvirkes av hvordan materialet taes ut, celletettheten i kulturene og de ulike medier som benyttes. Det har derfor vært en diskusjon om det er de samme cellene man undersøker i de ulike prosjektene og miljøene.

På slutten av 70-tallet beskrev Simmons og Torok-Storb (10) det første monoklonale antistoffet, Stro-1, som spesifikt er rettet mot stromale prekursorceller i human benmarg. Cellesortering på Stro-1 positive celler har vist en anriking av CFU-F, og Stro-1 (CD 90) brukes derfor som en positiv markør.

Det er også viktig å vise at MSC er negative på de hematopoietiske markørene CD34 og CD45. CD13 og CD105 er uspesifikke, positive markører for benmargsstroma, mens CD14 som uttrykkes på monocytter skal være negativ. CD31, som blant annet uttrykkes på endoteliale celler, skal også være negativ på MSC.

Cellenes fenotype ble bestemt ved enkeltmerking med PE-konjungerte monoklonale antistoffer; IgG1PE (BD), CD13PE (DAKO), CD14PE (DAKO), CD31PE (BD), CD34PE (BD), CD45PE, CD90PE (PharMingen), CD105 (Ancell) og kjørt på Becton Dickinson FACSort flowcytometer (se tabell 3).

Cytokinprofil: Vi ønsket å undersøke om cellene endrer cytokinprofil avhengig av hvilket medium de ble dyrket i, med og uten føtalt kalveserum. Cellenes produksjon av cytokiner er interessant å se på i forhold til at mesenchymale celler har vist seg å kunne dempe gvh-reaksjoner, og fordi cellene kan stimulere hematopoiesen gjennom sekresjon av ulike cytokiner i miljøet.

Vi lot celler gå i kultur 72 timer i de ulike mediene før supernatanten ble tatt av og frosset. Alle prøver ble tint og kjørt samtidig, og cytokinkonsentrasjon ble målt med 27 plex kit på BIO-RAD Bio-Plex system, (BIO-RAD Laboratories, Inc. Hercules CA) (se tabell 4).

Resultater

Ex vivo ekspansjon: Tabell 1 viser at celler som har gått i LP02 medium med platerikt plasma har en hurtigere vekst/større evne til proliferasjon enn celler dyrket i standard medium med FCS.

Klonogen vekst: Tabell 2 viser ulike ADAS-celler i forskjellige passasjer. Våre data tyder på at den klonogene evnen er noe dårligere når cellene dyrkes i medium uten FCS. Vi så tilsvarende tendens på MSC fra BM.

Evnen til kolonidannelse ser også ut til å avta i sterkere grad i senere passasjer når cellene dyrkes uten kalveserum. Våre forsøk kan tyde på at celler som skal kunne brukes klinisk bør være i tidlige passasjer når det benyttes medium uten tilsetning av kalveserum.

Differensiering: Våre data viser at MSC fra benmarg og ADAS-celler kan differensiere til adipocytter og osteoblaster selv om cellene har vært dyrket uten kalveserum i primærkulturen. Bilder 1-3 viser ADAS-celler dyrket i LP02-medium tilsatt platerikt plasma. Bilde 1 og 2 viser differensiering til osteoblaster, farget med henholdsvis van Kossa og alkalisk fosfatase. Bilde 3 viser ADAS-celler som har differensiert til adipocytter og fettdråpene er påvist med Oil Red O. Vi fant tilsvarende differensiering også for MSC fra benmarg som hadde gått i LP02-medium med platerikt plasma før differensiering.

Diskusjon og konklusjon

Ut i fra våre studier ser det ut til at mesenchymale celler både fra benmarg og ADAS-celler fra fettvev viser god proliferasjon og beholder samme evne til differensiering også når de dyrkes i LP02 medium med platerikt plasma. Fenotypen ser også ut til å bevares i forhold til de samme cellene dyrket i standard medium med føtalt kalveserum.

Fettvev er svært cellerikt, og dessuten lettere tilgjengelig enn benmarg. Derfor kan fettvev være en viktig stamcellekilde i klinisk sammenheng.

Platerikt plasma er veldig rikt på vekstfaktorer, og resultatene i tabell 1 viser at cellene får en sterk økning i ekspansjon når dette benyttes som supplement i mediet. Kanskje dette også kan forklare resultatene i tabell 2, hvor det ser ut til at cellene mister den klonogene evnen i større grad når de dyrkes over mange passasjer. Andre publikasjoner har også vist at mesenchymale celler gradvis mister sine karakteristiske stamcelleegenskaper når de dyrkes ex vivo (13). Flere forsøk må imidlertid utføres for å kunne si noe om mekanismene bak dette.

Andre studier (12) har dessuten vist at sjansen for spontanmutasjoner og transformasjon til maligne celler øker når celler går i kultur over mange passasjer. Dette tilsier at mesenchymale celler som skal brukes klinisk må være fra tidlige passasjer.

Mesenchymale celler skiller ut en rekke cytokiner, som vist i tabell 4.

Cytokinutskillelsen fra cellene viser noen endringer når mediet endres, selv om profilen i grove trekk er uforandret (se tabell 4). IL-8 avtar vesentlig for mesenchymale celler fra benmarg når medium med kalveserum erstattes med LP02 med PRP, uten at vi ser den samme tendensen når det gjelder ADAS-celler. Vi ser en svak motsatt tendens for IL-6. Vi ser også en økning av MCP-1 og VEGF for begge celletypene når medium med kalveserum erstattes med LP02 med PRP. VEGF har en viktig rolle i angiogenesen, og videre dyrestudier gjøres for å studere hvilken rolle de mesenchymale cellene har på nydannelse av kar. Vi studerer også in vivo hvilken evne MSC har til å danne benvev(11). Dette kan være interessant i forbindelse med mulig reparasjon av skjellettskader etter strålebehandling.